南湖新闻网讯（通讯员 王棪）光合作用是地球生态系统能量流动与物质循环的核心，叶绿素作为光系统的核心色素，其合成过程受到多种胁迫。原卟啉（PPIX）是叶绿素与血红素的共同前体分子，该物质具有强光敏性，受光激发后产生单线态氧（¹O₂），造成叶绿素合成关键酶损伤，进而抑制光合生物的正常生长。此前，华中农业大学端木德强团队已证实，胆色素（血红素的代谢产物）与GUN4 蛋白非共价结合，调控镁螯合酶（MgCh）活性，并稳定其核心催化亚基 CHLH1，保障叶绿素正常合成。
近日，该团队联合美国加州大学戴维斯分校、德国洪堡大学、中国科学院遗传与发育生物学研究所等国内外科研团队，进一步揭示了GUN4-胆色素共价结合介导的光适应新机制，研究成果以“Covalent phytobilin adducts of GUN4 implicate a photoprotective mechanism in chlorophyll biosynthesis”为题，发表于《美国国家科学院院刊》（PNAS）。
镁离子螯合酶MgCh是叶绿素合成途径的第一个关键酶，由CHLH、CHLI、CHLD三个亚基组成，其中CHLH是结合底物PPIX的核心亚基，而GUN4是放氧型光合生物（蓝细菌，真核微藻，植物）中普遍存在的MgCh的调控蛋白。血红素经血红素加氧酶（HMOX1）、铁氧还蛋白依赖型胆色素还原酶（FDBR）依次催化，生成胆色素分子。本研究选用莱茵衣藻作为研究体系，该物种不含光敏色素（phytochrome）、藻胆蛋白（phycobiliprotein）等已知的胆色素受体或结合蛋白，是探究胆色素新型功能的理想材料。
图1. 衣藻不同突变体中原卟啉 (PPIX) 的积累
研究团队综合运用遗传学、生物化学、光谱学、质谱分析等多种技术开展系统研究。结果表明：gun4 单突变体、hmox1 单突变体及 hmox1 gun4 双突变体细胞内均大量积累PPIX，其中双突变体的PPIX含量达到野生型衣藻的187倍。过量积累的PPIX 在光照条件下生成单线态氧，导致 CHLH1 蛋白降解、叶绿素合成受阻，突变体在强光、近紫外光环境中的生长受到严重抑制。
科研人员进一步探究单线态氧的信号通路，发现敲除莱茵衣藻中单线态氧响应核心蛋白 SAK1、SOR1 后，可显著缓解 gun4、hmox1 突变体的光敏感表型。这一结果证明，GUN4 与胆色素可通过调控胞内单线态氧稳态，影响叶绿体-细胞核逆向信号通路。
图2. 敲除 SAK1或SOR1可恢复gun4/hmox1突变体的生长
经过体内外实验，研究团队发现，在 PPIX、紫外光与氧气的共同作用下，GUN4与胆色素（PCB）形成共价加合物；而胆色素前体胆绿素（biliverdin, BV）无法介导该共价结合过程。同时证实，该现象并非莱茵衣藻独有，在蓝细菌、高等植物等光合生物的GUN4蛋白中均保守存在。
图3. GUN-胆色素共价结合在蓝细菌、微藻和植物中均保守
研究团队利用定点突变技术，锁定了 GUN4 蛋白中调控共价结合与生理功能的关键氨基酸位点。色氨酸 Trp189 是 GUN4-PCB 共价加合物形成的必需位点，该位点突变后，菌株无法合成共价加合物，在强光、紫外胁迫下 GUN4 与 CHLH1 蛋白大幅降解，光合生长缺陷表型最为显著；Trp135、Trp200 主要负责维持GUN4与CHLH1的蛋白互作，同时调控共价加合物的形成效率。光谱分析结果显示，PCB 结合可保护GUN4的色氨酸残基免受单线态氧的氧化损伤，同时 GUN4也能抑制PCB发生光降解，二者形成相互防护的动态体系。
图4. Trp135、Trp189、Trp200 及 Asn219 是维持GUN4功能的关键氨基酸
本研究还提出了四种模型。GUN4首先与PCB形成非共价复合物，并结合携带底物PPIX的CHLH1蛋白；CHLH1结合的PPIX在光下产生单线态氧，进而诱导PCB与GUN4发生共价结合。形成的GUN4-PCB共价加合物具备两个核心功能。一方面，可直接发挥抗氧化、光保护作用，清除单线态氧毒性，阻止 CHLH1 持续光氧化降解，保障镁螯合酶正常功能与叶绿素合成；另一方面，可作为特异性的叶绿体氧化胁迫信号，影响叶绿体-细胞核逆向信号传递，调控细胞对光氧化胁迫的应答。
图5. GUN4-PCB 的共价互作及单线态氧信号应答的工作模型
该研究解答了“多数真核藻类缺失藻胆蛋白、光敏色素等经典胆色素受体或结合蛋白，却依然保留完整的胆色素合成通路”这一科学谜题，证实了胆色素和GUN4形成的共价加合物是实现光保护的核心分子，从进化层面解释了胆色素合成通路在放氧型光合生物中普遍保守的原因。该成果建立了光合生物四吡咯代谢网络与光氧化胁迫耐受的关联，丰富了对四吡咯分子生物学功能的理解。
本研究由华中农业大学端木德强教授团队牵头，联合美国加州大学戴维斯分校（Nathan Rockwell）、德国洪堡大学（Bernhard Grimm）、中国科学院遗传与发育生物学研究所（汪迎春，黄夏禾）相关团队共同完成。端木德强教授与Nathan C. Rockwell 研究员为论文共同通讯作者，在读博士生王棪为论文第一作者。衣藻基因编辑得到西湖大学李小波研究员和杨雨青博士的帮助，研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室自主课题等项目的资助。
【英文摘要】
In the green alga Chlamydomonas reinhardtii, loss of chlorophyll synthesis under light stress is associated with degradation of the porphyrin-binding H-subunit (CHLH1) of magnesium chelatase (MgCh). This degradation is exacerbated by the absence of GENOMES UNCOUPLED 4 protein (GUN4) or its phycocyanobilin (PCB) ligand. PCB is synthesized from heme via the action of heme oxygenase HMOX1 followed by a ferredoxin-dependent bilin reductase (FDBR), a ubiquitous enzyme family in oxyphototrophs. We show that C. reinhardtii cells lacking GUN4 and/or HMOX1 accumulate the MgCh substrate protoporphyrin IX (PPIX), a potent generator of singlet oxygen (1O2). CHLH1 is unstable in gun4 or hmox1 mutants, phenotypes that can be rescued by deletion of known cytosolic 1O2 response proteins SAK1 or SOR1. GUN4 Trp residues are oxidized in the presence of PPIX and near-ultraviolet light (nUV), and spectroscopic changes in GUN4 seen in the presence of PCB are ablated by PPIX and nUV. The combination of PPIX, PCB, and nUV result in formation of covalent GUN4–bilin adducts. Such adducts are formed both in vivo and in vitro and are also formed in GUN4 proteins from cyanobacteria and plants. In GUN4 variants, loss of adduct formation correlates with Chlamydomonas growth defects under light stress. We propose that phytobilin adduct formation provides a mechanism for detoxifying 1O2 and sustaining chlorophyll synthesis in the presence of light and oxygen, thereby explaining the ubiquity of FDBRs in eukaryotic algae.
论文链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2533100123
